การโคลนยีน

การโคลนยีน

DNA สายผสมที่ได้จากการตัดและต่อนี้ยังไม่สามารถทำงาน ได้ต้องมีวิธีการที่จะดำรง  DNA สายผสมให้คงอยู่และเพิ่มจำนวนเพื่อใช้ในการศึกษาว่า  สาย DNA เหล่านั้นควบคุมการสร้าง โปรตีนชนิดใดและศึกษาว่า DNA  ยีนอะไรบ้าง  สิ่งที่จำเป็นคือ จะต้องเพิ่ม DNA  ในบริเวณดังกล่าวให้มากพอที่จะศึกษาได้ การเพิ่ม DNA ที่เหมือนกันนั้นเรียกว่า  “การโคลนดีเอ็นเอ (DNA cloning)” หาก DNA บริเวณดังกล่าวเป็นยีนก็อาจเรียกว่า  “การโคลนยีน  (gene cloning)” การโคลนยีนโดยอาศัยพลาสมิดของแบคทีเรีย การโคลนยีนวิธีหนึ่งที่เป็นที่นิยมกัน  คือ อาศัยวิธีการเพิ่มจำนวนชุดของ  DNA ในพลาสมิด (plasmid) ของแบคทีเรีย ซึ่งถือว่าเป็น DNA พาหะ (vector)  สำหรับการโคลน DNA อย่างหนึ่งในแบคทีเรีย 1 เซลล์ อาจมีพลาสมิด 1 - 300 ชุด เมื่อนำเซลล์แบคทีเรียไปเลี้ยงเพื่อเพิ่มจำนวนชุดของพลาสมิดก็จะ เพิ่มขึ้นด้วย   ซึ่งส่วนของ DNA ที่ต้องการที่แทรกไว้ไนพลาสมิดก็จะเพิ่มขึ้นตามโดยปริยาย

ขั้นตอนของการทำงานของเครื่องเทอร์มอไซเคลอร์ โดยใช้เทคนิค PCR 
                1. ขั้นตอนแรกนี้เรียกว่า “Denaturation” เพิ่มอุณหภูมิของเครื่องให้สูงขึ้นจนสาย DNA สายคู่ที่เป็นแม่แบบแยกออกจากกันเป็นสายเดี่ยว (ขั้นนี้อุณหภูมิประมาณ 90 ◦)
                3. ขั้นตอนที่สามเรียกว่า 
                3. ขั้นตอนที่สามเรียกว่า “Extension” ปรับอุณหภูมิให้เหมาะสมต่อการทำงานของเอนไซม์ DNA พอลิเมอเรส เพื่อให้สร้างสาย DNA สายคู่เพิ่มขึ้น (ช่วงอุณหภูมิที่เหมาะสมต่อการทำงานของเอนไซม์ DNA พอลิเมอเรส คือ ประมาณ 72 ◦-75 ◦)
                4. เริ่มกระบวนการในขั้นที่ 1 ใหม่จะได้ DNA สายคู่ 2 สาย เพิ่มเป็น 4 สายคู่ 8 สายคู่ และ 16 สายคู่  ตามลำดับไปเรื่อยๆ จนมากพอกับความต้องการ

 ภาพการสร้างสาย DNA โดย พอลิเมอเรส เชน รีแอกชัน (PCR)
                จะเห็นได้ว่าเทคนิค PCR  นี้จะเพิ่มปริมาณ DNA 

ที่ต้องการที่มีปริมาณน้อยให้มากได้อย่างรวดเร็ว  

แต่อย่างไรก็ตามเทคนิค PCR ยังมีข้อจำกัดอยู่ คือ 

ขั้นตอนการแสดงของยีน เช่น 
การสร้างโปรตีนและขั้นตอนการตรวจสอบความผิดพลาดของ DNA 

ที่สร้างขึ้น เนื่องจากเอนไซม์ที่ใช้ในปฏิกิริยานี้บางชนิด

ไม่มีการตรวจสอบลำดับนิวคลีโอไทด์ของ DNA

 เหมือนในระบบของเซลล์สิ่งมีชีวิต
             อย่างไรก็ดีเทคนิค PCR นี้ ได้นำมาใช้กับการเพิ่มปริมาณของ

 DNA ที่มีอยู่ในปริมาณน้อย เช่น ในคราบเลือด คราบอสุจิ 

เนื้อเยื่อบางชนิด เชื้อHIV  DNA ของเอ็มบริโอในครรภ์มารดาว่าผิดปกติหรือไม่ 
 รวมทั้ง DNA จากซากของวอลลี แมมมอธ (Wolly mammoth)

 ด้วยเพื่อดูถึงวิวัฒนาการของสัตว์ชนิดนี้

 หากส่วนของ DNA ที่แทรกไว้เป็นยีนก็อาจนำไปใช้ประโยชน์ต่อไป

                1. DNA แม่แบบ (DNA template) ซึ่งเป็น DNA

 ที่ต้องการโคลนหรือเพิ่มจำนวน

 3. นิวคลีโอไทด์ทั้ง 4 ชนิด ประกอบด้วย dATP (A) , dGTP (G) , dCTP (C) 

                4. เอนไซม์ DNA พอลิเมอเรส ชนิดพิเศษ

และ dTTP (T)

                2. ขั้นตอนที่สองเรียกว่า “Annealing” ลดอุณหภูมิลง

 (เหลือประมาณ 55 ◦) จะทำให้ DNA ไพรเมอร์จับกับ DNA

 แม่แบบสายเดี่ยวแต่ละสายในตำแหน่งที่เป็นจุดเริ่มต้น

ในการสังเคราะห์ DNA ด้วยพันธะไฮโดรเจน

การโคลนยีนในหลอดทดลองโดยเทคนิค  พอลิเมอเรสเชนรีแอกชัน หรือ พีซีอาร์                     ในปัจจุบันสามารถเพิ่มจำนวน DNA ในหลอดทดลองได้แล้ว   โดยใช้เครื่องมือที่เรียกว่า “เทอร์มอไซเคลอร์ (thermocycler)”  โดยเครื่องมือนี้สามารถควบคุมอุณหภูมิให้ปรับเปลี่ยนตามกำหนด เวลาที่ตั้งไว้ได้  ในการโคลนยีนโดยใช้เทคนิคพอลิเมอเรสเชนรีแอกชัน หรือ พีซีอาร์  (polymerase chain reaction ; PCR)  นี้ต้องอาศัยเอนไซม์ DNA พอลิเมอเรส (DNA polymerase)  ชนิดพิเศษที่ทนความร้อนหรือทนที่ที่มีอุณหภูมิสูง ได้โดยเอนไซม์ชนิดพิเศษนี้จะแยกออกมาจากแบคทีเรีย ที่อาศัยอยู่บริเวณน้ำพุร้อนซึ่งจะทนสภาพ อุณหภูมิสูงได้